第二幕


　フォルテリンガ城の庭園。久しぶりに庭に出ることを許されたマリアは、侍女のアンナとともに外の気持ちよい空気を満喫している（「ごらん、麗しく美しい野原がひらけ」）。そこにレスター伯爵が現れ、女王との会見を恐れるマリアを優しく慰め、恭順の意を表して赦免を願い出るように勇気づける（「世界から見放され、王座から離れても」）。
　やがて女王の一行が到着するので、マリアは低姿勢で赦免を願うが、マリアとレスター伯爵の関係に気づいて嫉妬に燃えた女王は、かえってマリアの罪状を暴き立てる。我慢し切れなくなったマリアは、自分こそ正当な王位継承者だと言って庶子のエリザベッタを激しく攻撃するので、怒った女王は衛兵にマリアの逮捕を命じ、一同混乱の中に幕となる。


第三幕


　第一場　ウェストミンスター宮殿のエリザベッタの私室。女王はマリアの死刑執行書へのサインを躊躇しているが、セシル卿は署名を進言する。
　そこにレスター伯爵が現れ、なおもマリアの赦免を願い出るので、嫉妬に燃えた女王は死刑執行書に署名し、レスター伯爵に死刑に立ち会うよう命じる。
　第二場　フォルテリンガ城の牢獄。マリアが嘆いていると、セシル卿とタルボが死刑の判決文を持って入って来る。マリアはタルボ一人に残るように言うと、彼はカトリックの僧になったとマリアに告げる。
　死を覚悟したマリアは彼の前で罪の懺悔をするが、イギリスで罪になるようなことは何もしていないと潔白を断言する。その上で、すべての苦悩から解放されるために死刑を受けると言う。
　第三場　処刑室の次の間。マリアの友人たちが彼女の残酷な運命を嘆いていると、黒い喪服を着たマリアがタルボに伴われて現れ、最後の祈りを捧げる。死刑執行を伝える第一の大砲の音が聞こえ、セシル卿が姿を現す。
　マリアは今まさに死のうとしながらも、自分を死に追いやった女王を許すと言う（「今死のうとしているこの心が」）。レスター伯爵が現れ、マリアは彼と別れの二重唱を歌うと、第二の砲声が聞こえ、マリアは死刑台を静かに上がって行く。
　そして安らかな気持ちで神のおそばに旅立つことを高らかに歌う。第三の砲声が聞こえ、人々は涙にくれる。